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琼脂糖凝胶电泳常见问题与解决办法

 

一.凝胶制备

1.微波炉溶解琼脂糖时,胶液沸腾冲溢出三角锥瓶微波炉加热时胶液可能发生剧烈沸腾,

 1)总液体量不宜超过三角锥瓶的 50% 容量,

 2)2% 以上胶液设置中火加热

 3)胶液剧烈沸腾时,停止加热,移开三角锥瓶,请戴上防热手套,小心摇动三角锥瓶,然后再次加热,胶液沸腾直至胶液

清澈,保证琼脂糖完全溶解。

2.琼脂糖电泳图像背景模糊不清

琼脂糖没有完全溶解会造成电泳图像背景模糊不清。 完全溶解的琼脂糖胶液清澈,三角锥瓶内壁应没有粘附琼脂糖颗粒。

3.加热后水分蒸发,如需要应加入热的蒸馏水,补足到原来的重量,摇匀。

二. 电泳

1.DNA 条带模糊,拖尾

 1) DNA 降解。避免核酸酶污染。

 2) DNA 上样量过多。减少凝胶中 DNA 上样量。

 3) 电泳缓冲液陈旧: 电泳缓冲液多次使用后,离子强度降低, pH 值上升,缓冲能力减弱,从而影响电泳效果。建议经常更换

  电泳缓冲液。

 4)电泳条件不合适。电泳时电压不应超过 20V/cm ,温度<30 ℃ ,巨大 DNA 链,温度应<15 ℃,核查所用电泳缓冲液

  是否有足够的缓冲能力。

 5)DNA 样含盐过高。泳前通过乙醇沉淀去除过多的盐。

 6)有蛋白污染。电泳前抽提去除蛋白。

 7) DNA 变性。电泳前勿加热,用 20mM NaCl 缓冲液稀释 DNA 。

2.DNA 条带淡弱或无 DNA 带

 1) DNA 的上样量不够:增加 DNA 的上样量。

 2) DNA 降解:避免 DNA 的核酸酶污染。

 3) DNA 走出凝胶:缩短电泳时间,降低电压,增强凝胶浓度。

 4)分子大小相近的 DNA 带不易分辨。增加电泳时间,使用正确的凝胶浓度。

 5) DNA 变性:电泳前请勿高温加热 DNA 链,用 20mM NaCl Buffer稀释DNA 。

 6) DNA 链巨大,常规凝胶电泳不合适。在脉冲凝胶电泳上分析。

3.DNA MARKER 条带扭曲

 1)配制凝胶的缓冲液和电泳缓冲液不是同时配制的。使用同时配制的缓冲液。电泳时缓冲液高过液面1 - 2mm 即可。

 2)电泳时电压过高。可以在电泳前 15 分钟用较低电压 (3V/cm), 等条带出孔后,再调电压。

 3)尽量慢慢加样 ,等样品自然沉降后再加电压。


 
 
   
 

 

 
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